基于CRISPR/CAS9的基因敲除敲入服务 二维码
苏州东岭生物技术有限公司（东岭生物，DL Biotech）创建于2016年，拥有在干细胞和肿瘤免疫研究领域深耕数十年的技术团队，企业愿景是成为国内领先的免疫治疗药物研发技术服务供应商，同时研发生产关键试剂替代进口。经过4年多的努力，公司已建成干细胞/免疫细胞系统鉴定检测平台和基因编辑平台，可为免疫治疗药物研发机构提供定制服务方案及工具产品。 CRISPR/Cas9是一种在特定目标位置切割DNA的工具，Cas9蛋白可在sgRNA的引导下对特定基因进行剪切，从而达到基因敲除、敲入以及修饰、调控等目的。 敲除：与常规的shRNA敲低不同，CRISPR/CAS9和sgRNA可特异性的在基因组水平造成碱基的缺失或插入（INDEL），造成原有基因表达框的破坏，造成靶基因蛋白水平的完全敲除（图1左）。 敲入：与常规病毒介导的过表达不同，CRISPR/CAS9和sgRNA在特定基因组位点切割后，可在带有同源臂的修复模板引导下，将待敲入的基因插入到目的位点，不同于病毒介导的随机整合（图1右）。
图1：CRISPR/CAS9工作示意图 图片出引自：Front. Plant Sci., 24 May 2016 东岭提供CRISPR/CAS9敲除和敲入环节所需的载体和病毒，亦可为客户提供一站式服务，周期及项目见下表：
注：定制服务包括敲入服务、稳定细胞株构建。 其他服务项目：
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图2：T7E1检测基因组水平功能验证。将针对靶基因设计的5条sgRNA构建到sgRNA病毒载体，通过顺转导入CAS9稳转工具细胞株，可到＞70%转染效率。转染3天后收集细胞基因组进行T7E1检测sgRNA切割效率，可见sgRNA 1/ 2/ 3/ 5均有较高切割效率。
图3：成功构建基因敲除单克隆细胞株。将sgRNA1多克隆细胞进行单克隆铺板，扩增后的单克隆收集基因组通过PCR获得目的基因片段，进行测序发现克隆1/2分别有单个碱基和多个碱基的缺失突变，靶基因敲除单克隆细胞株构建成功。 东岭团队经过长期积累，已改造获得多种CRISPR/CAS9及sgRNA相关载体用于敲除和敲入，以及spCAS9稳转工具细胞株供客户直接使用，具体信息如下表：
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